中华耳科学杂志,年18卷5期
干细胞联合人工耳蜗植入治疗感音神经性聋的研究现状
王梅王新兰钟翠萍
听觉是人类感知外界事物的重要方式之一，听力损失会给个人、家庭及社会带来沉重负担。目前全世界大约有4.66亿人患有永久性听力丧失，SNHL约占所有听力损失病例的85%，其中儿童占万人[1]，听力损失影响儿童的认知、语言和社会心理发展，而在老年人中，听力损失同样与认知能力下降和抑郁有关。造成SNHL的原因有很多，其中主要原因包括外伤、接触耳*性药物、基因突变、病*感染、炎症或内淋巴水肿等。目前SNHL的主要治疗方法是佩戴助听器和植入人工耳蜗，对于重度SNHL助听器治疗效果并不显著，相反人工耳蜗植入通过电刺激听觉神经将听觉信息传递至中枢，对于改善听力相对有效。位于内耳的感觉毛细胞及其所连接的SGNs在人工耳蜗通过电刺激将外界声音转化为电信号并传输至中枢神经的过程中起重要作用。但是临床实践表明，并不是所有患者在人工耳蜗植入后都能达到预期效果，经研究发现听觉神经的数量与功能在人工耳蜗传递至大脑的信息质量方面起重要作用，也就是说听神经功能退化是影响人CI术后效果的一个重要因素。以往对于CI术后病人尸体颞骨组织病理学研究发现，所有CI术后患者颞骨均有不停程度的损伤和炎症反应[2]，人工耳蜗植入术后炎症反应普遍存在，以耳蜗入口处炎症反应较远侧炎症反应更为强烈，提示耳蜗植入损伤是炎症的促发因素之一[3]。另有Seyyedi[18]的研究证实了CI术后通常导致SGNs退化，导致植入耳中的平均SGNs计数低于未植入耳中的计数，而SGNs的损伤是不可逆的[3]。很多研究者正在寻找延缓或防止神经变性并使其恢复到正常状态的方法，但是结果并不理想。因此，学者们开始寻找更有效的治疗方法，干细胞移植联合人工耳蜗植入作为一种新的有望用于临床的治疗方法被推出。本文旨在对干细胞移植、CI术后效果与SGNs计数、神经营养及电刺激治疗之间的关系进行综述，并且讨论CI联合干细胞移植面临的治疗难点。
1SGNs计数与CI患者预后之间的关系
SGNs作为听觉神经的传入轴突，以及人工耳蜗植入物的主要靶器官，其主要是通过电刺激SGNs，将耳蜗毛细胞的外周听觉信息传递到中枢听觉通路。迄今为止，改善SNHL患者听觉的主要途径是通过人工耳蜗植入对残余SGNs的慢性电刺激从而获得部分听觉[4-6]。而广泛的SGNs变性可能对耳蜗植入物的临床疗效产生负面影响。因此，了解耳聋后SGNs的存活状态对于这些神经元保护和再生的策略是很重要的。
SGNs是一级神经元，它将人工耳蜗产生的电刺激传递给中枢神经系统。目前有许多研究者以SNHL患者残余SGNs数量和CI术后效果是否存在存在一定相关性，进行研究。Khan[7]等人曾对15名单侧CI尸体颞骨组织学研究发现残余SGNs数量与语言识别能力之间无显著相关性。Xu[8]等在对4名受试者的颞骨研究中得出了相似的结论。Linthicum[9]在其研究中表明长期耳聋患者的人工耳蜗植入效果不佳与SGNs的持续退化无关。但Fayad[10]在14名CI患者遗体颞骨的组织学检查中，发现CI术后残余SGNs的数量与患者术后表现呈显著负相关（r=-0.，P≤0.）。而Otte[11]等人在对82具未植入人工耳蜗的SNHL患者遗体颞骨研究中，报告了SGNs数量与语言识别能力的显著相关性。另有研究证实，受试者的双耳因相同的病因导致耳聋，则双侧耳蜗的SGNs计数在统计学上没有差异[12]。Seyyedi[13]在控制耳聋病因、年龄和认知能力等多个变量的情况下，对以单耳为对照的双侧IC植入后耳蜗残余SGNs计数与语言识别能力之间的相关性进行研究，优化后的匹配技术使得语言识别分数与SGNs计数的差异具有很强的相关性（r=0.，P值=0.，n=6）。Wise[14]的研究显示随着耳聋时间的延长，SGNs数量显著降低。Long[15]和他团队的研究结果表明，SGNs丢失是CI术后语言理解能力降低的重要因素，其结果同样解释了CI患者临床结果的变异性高，并证实了非创伤性手术、保护性或再生性干预研究的重要性。
尽管SGNs数量并不太可能是CI术后影响听力的唯一决定因素，但是越来越多的研究证明大量存活的SGNs对于CI术后患者预后有有利影响，组织病理学与患者临床症状研究相结合有助于进一步阐明SGN存活数量与CI术后患者听力相关。
2CI患者预后与神经营养治疗及电刺激治疗之间的关系
存活SGNs数量和完整性、其与中枢连接的健康状况、耳蜗电极与神经元的接近程度以及长时间没有听觉输入后中央听觉通路连接退化的程度等因素可能会影响CI术后效果[16,17]。Seyyedi[18]和Leake[19]等人报道通过人工耳蜗植入的慢性双极性刺激对SGNs的生存有保护作用。同样，有报道称，脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养因子3（NT3）等可以促进重度SNHL患者SGNs的存活。
有研究表明，人工耳蜗植入体的慢性电刺激可以辅助外源性神经营养因子（NT）提高SGNs存活率，当去除NT供应后，持续的慢性电刺激可维持显著的SGN生存效应[20,21]。在此基础上，Wise[22]等将含有绿色荧光蛋白标记的腺病*载体（含/不含BDNF和NT3）基因注入耳蜗鳞片介质室，结果表明NT基因治疗对于SGNs有明显保护作用，但其保护作用随着耳聋持续时间的增加而降低。因此，将耳蜗植入物的电刺激与NT基因治疗结合起来，可以提高SGNs存活率[23]。此外，富含生长因子的部分血液成分有望通过提高SGNs存活率及其与电极的粘附性来优化人工耳蜗和SGNs中的电极-神经相互作用[24]，有必要进行进一步研究，以验证它们在体内的作用机理，并得出临床适用的生物疗法。
Landry[25]等利用致聋豚鼠耳蜗研究慢性电刺激治疗后的耳蜗组织病理学反应，结果显示长期耳聋受试者在NT治疗后耳蜗的SGNs存活率增加（双向方差分析，P0.05），听觉电生理检测（EABR）阈值降低，同时表明慢性电刺激并不能提高SGNs生存率，并解释与其他实验得出不同结果可能是方法上的差异，包括治疗前耳聋持续时间、治疗技术以及刺激参数等方面的因素。Hadler[26]在其研究中表述电极插入后，炎症因子、异物、血液等对外淋巴液的污染和手术局部感染会造成结缔组织过度生长，导致电极-组织界面的阻抗增加从而影响了不同声音频率对选择性神经元的的刺激，作者利用带正电荷的聚（2-甲基丙烯酰氧基）乙基三甲基氯化铵（PMTA）促进了胶质细胞的粘附和增殖，间接地增加SGNs的营养支持及轴突的生长。有人指出，在SGNs存活率较低或不稳定的患者耳蜗中，人工耳蜗植入体慢性电刺激对SGNs保护作用的有效性显著降低[27]。
人工耳蜗植入物和周围神经刺激相关研究表明，电刺激可促进神经元损伤后的轴突生长[14]。最近有研究表明丙戊酸能促进SGNs神经分化，使轴突生长旺盛，从而在与CI结合时恢复听力[28]。由于听觉神经元和CI电极之间的解剖学间隙导致电流扩散和非特异性神经刺激，CI用户的频率辨别很差，Li[29]和他的团队通过使用可生物降解的磷酸钙纳米球（CPHS）涂敷在CI电极上并装载神经营养蛋白，结果表明，通过CPHS涂层递送神经营养素来关闭听觉神经元与电极之间的解剖学差异，从而使CI患者的选择性神经激活和良好听力成为可能。
3人诱导多能干细胞（iPSC）实现SGNs的再生与修复
使用干细胞替换丢失的听神经并改善它们的中枢连接是一种可以用来提高耳蜗植入体性能的方法。有人已经研究了干细胞在耳蜗康复中的应用，包括毛细胞和听觉神经元的替换。干细胞疗法在耳蜗中的主要作用是替换受损或丢失的听觉细胞。动物研究证明，现在已经有多种类型干细胞被输送到内耳用于毛细胞或SGNs的替代治疗，其中包括骨髓干细胞[30]、胚胎干细胞[31]以及人iPSC等对以往研究总结发现间充质干细胞及iPSC相对安全[32]。iPSC由日本学者通过人为表达四种基因（转录因子OCT4，MYC，SOX2和KLF4）重新编程成纤维细胞使之进入多能状态（类似胚胎干细胞）[33]，获得有自我更新和分化的全能性，从理论上讲，人iPSC可从移植个体自身取得，从而避免了免疫排斥反应及伦理学问题，并具有大规模生产的潜力。
已有报告描述了小鼠iPSC细胞向听觉神经元的分化。王翠翠[34]等人利用iPSCs的定向分化，发现iPSC可分化为内耳祖细胞并且具有向内耳毛细胞分化的潜能，将分化后的内耳祖细胞移植到具有Mitf-M基因突变耳聋猪模型内耳中，移植四周后发现在柯替氏器周围靠近盖膜的地方发现了标记细胞，但是只有少数细胞整合到听觉上皮组织中。一项体外培养的毛细胞研究中，人iPSC衍生的神经元可以直接与突触形成突触前连接，此外，还观察到在分化早期阶段，来自神经细胞的神经祖细胞具有更高的神经支配潜能[35]。Chen[36]等研究了人iPSC诱导的上皮祖细胞在小鼠耳蜗中的迁移、分化和突触连接，结果证实iPSC衍生的上皮祖细胞可以分化为具有典型的形态学特征和电生理特性的类毛细胞，在体外，上皮祖细胞衍生的类毛细胞在共培养中与SGNs形成突触连接，在体内，部分移植细胞迁移到位于皮质醇器官内的毛细胞的位置，分化成类毛细胞，并与耳源性SGNs形成突触连接，这也许可以成为iPSC在听觉细胞替代中的研究基础，从而进一步研究耳聋患者干细胞移植联合CI治疗的可能性。
4干细胞移植联合人工耳蜗植入治疗的难点及挑战
近年来，毛细胞的相关研究取得了巨大的突破。从细胞系的建立，到一套成熟的培养方法的建立，再到后来的毛细胞以及类毛细胞的成功诱导以及分化各阶段的检测策略的建立等，都是研究者们不断探索成功的结果。但是目前仍有许多挑战：①SGNs再生及诱导率问题，SGNs诱导率还很低。②再生毛细胞及SGNs生理功能问题。虽然已有多种体外毛细胞检测判定方式，但都比较片面，目前无公认的权威方法来判定毛细胞或类毛细胞的功能。③植入方式问题。尽管现在有多种植入方式，如从圆窗、蜗轴、半规管、鼓阶等，但以上方式都会对内耳结构产生一定的损伤，不利于残余听力的保存，未来可探索降低内耳损伤的移植方法，如腰椎穿刺蛛网膜下腔移植入路[37]。④植入后存活率以及发挥生理功能等问题都是目前面临的困难与挑战。干细胞移植联合人工耳蜗植入能否在形态和功能上融入耳聋患者的人工耳蜗环境以改善听力还不确定。有研究表明干细胞内耳移植不仅能替代受损的SGNs，同时还可以为其提供神经营养作用[38]。SGNs与毛细胞形成突触并持续接触才能存活，在Niliksha的研究中不仅证明人iPSC能与毛细胞形成功能性突触，同时表明了分化后的神经元具有明显的神经表达功能[35]。有理由认为干细胞源性神经元与耳蜗源性神经元之间的功能性突触的形成对于有意义的听觉处理至关重要。⑤到目前为止，大部分研究都停留在动物模型阶段，基于动物实验的研究结论推测用于临床的治疗效果，需要考虑人与动物生理学之间的差异。Roemer[39]用从骨髓中分离出具有释放抗炎和神经保护作用的多种因子的自体单核细胞，使用纤维蛋白粘合剂作为载体，研究出一种生物混合电极，并将其植入三名患者体内，这是使用自体细胞移植到人类内耳的第一份报告。虽然今后还需要大量列队研究资料来加以验证治疗效果，但这也是迈向临床治疗的一个良好开端。
当前临床上有耳蜗神经发育不良或未发育的患者，人工耳蜗植入的效果较差甚至无效，结合电刺激及神经营养治疗对干细胞影响的研究结果，干细胞移植修复内耳与CI结合也将会是解决这一类临床问题的研究热点。基于现有的研究基础及目前的科研技术，我们相信在未来干细胞移植联合CI将会给SNHL患者带来福音。
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