任淑敏
吴庆华
陈晨
孔祥东
医院遗传与产前诊断中心
导读
听力障碍是人类常见的出生缺陷之一，我国每年约有3万聋儿出生，还有6万-8万患有迟发耳聋的患儿被发现，其中大部分为重度极重度感音神经性聋，严重影响患者的交流和认知能力。
耳聋病因复杂，50%以上与遗传因素相关，且多为单基因遗传方式，具有高度的遗传异质性和表型的相似性，根据数据库查，目前发现导致非综合征型遗传性耳聋(non-syndromichearingloss，NSHL)的基因已达个，因此临床医生很难通过临床表型确定其致病原因。
在本研究中，我们应用二代测序结合Sanger测序的方法对2个遗传性耳聋家系进行了遗传性耳聋相关基因检测。
通过家系验证分析发现2个家系患儿均存在TMPRSS3基因致病突变后，为家系提供遗传咨询和产前诊断。
资料与方法
一、资料
研究对象为年3-12月就诊于医院遗传与产前诊断中心进行遗传咨询的2个耳聋家系。
家系1患儿女，7岁，新生儿听力筛查未过，听性脑干诱发电位(audiorybrainstemresponse，ABR)检测示双耳反应阈值均85dBnHL。
耳声发射(otoacousticemissions，OAE)检测双耳均未通过，颞骨CT未见明显异常，目前佩戴助听器。
家系2患儿男，13岁，5个月时因家长发现医院就诊，ABR检测双耳反应阈值均dBnHL，OAE检测双耳均未引出，颞骨CT未见明显异常，佩戴助听器效果欠佳，于2岁时行人工耳蜗植人。
两家系均因有再生育要求来我中心咨询。两家系患儿耳廓外耳道、鼓膜等耳科检查均正常，无耳外伤、中耳炎、耳*性药物所致的听力下降病史。
两家系患儿父母听力正常，非近亲结婚，双方家族内无其他耳聋患者。
在知情同意的原则下，对患儿进行耳聋基因检测，并收集患儿父母血样进行基因突变验证。
选取名体检健康无关个体为健康对照。
本研究经医院医学伦理委员会批准(KS--KY-36)，患儿家长签署知情同意书。家系图见图1。
图1两个耳聋家系图A：家系1；B：家系2
二、方法
1.基因组DNA提取：抽取家系中患儿及家系成员外周静脉血各2ml，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝后保存备用。
应用北京天根DNA试剂盒提取样本DNA，用超微量分光光度计(NanovuePlus，英国GEheatheare公司)测定DNA浓度，冻存于20C备用。
同时从我中心DNA数据库中选取名健康个体作为健康对照。
2.二代测序和数据分析：用外显子捕获芯片，将家系中的患儿DNA送至北京迈基诺基因检测公司。
选择遗传性耳聋检测包(包含个已知致病基因，包括核基因、相关线粒体区域及miRNA)进行高通量测序检测，测序平均深度为x，20x的靶向reads达到97%以上，与hg19比对得到所有突变的文件。
我们进一步对所有检测基因上的碱基突变进行筛选，在dbSNP、Hap-Map和千人基因组等数据库进行比对，排除已报道过的单核苷酸多态(singlenucleotidepolymorphism，SNP)。
针对可疑突变应用polyphen2、SIFT、MutationTaster等数据库进行生物信息学预测分析。
3.Sanger测序验证：参考Ensembl数据库中基因序列，应用GeneTool软件设计TMPRSS3基因的引物。
引物由上海生工生物有限公司合成(引物序列及聚合酶链反应产物长度见表1)。
PCR反应体系为：2x反应缓冲液预混液(MgPlus)13μl、TaKaRaTaq酶1μl、基因组DNA(30ng/ul)、引物(25pmol/μl)各1ul，补水至25pul。
反应条件：C预变性4min；94C30s，C30s，72°C30s，共32个循环；最后72C7min。
PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，以确定产物长度与预期一致。
PCR产物纯化后利用ABIBigDye3.1测序试剂盒，在ABIX1基因测序仪上对产物直接进行双向测序，用SequencingAnalysis5.1.1软件将数据进行比对分析。
4.致病性判定：通过检索人类基因突变数据库[HumanGeneMutationDatabase，HGMD(